Los ovocitos y los espermatozoides se colocan en contacto. Luego, tanto los ovocitos como los espermatozoides se colocan en un medio de cultivo favorable para su supervivencia y se introducen en el incubador a 37°C. Esta es la etapa de la fecundación in vitro.
Día 0: LA FECUNDACIÓN
Como hemos visto, existen dos métodos de fecundación posibles:
Cada ovocito se pone en contacto con una cantidad suficiente de espermatozoides móviles previamente preparados (de 50,000 a 100,000 espermatozoides) antes de ser colocado nuevamente a 37°C en el incubador, asegurándose de cumplir con condiciones físico-químicas precisas: temperatura, composición del medio, osmolaridad, pH, etc. El incubador mantiene los gametos a salvo de la luz, calientes y en un medio nutritivo adecuado.
Durante las horas siguientes, algunos espermatozoides atravesarán el cúmulo (nube de células) y se adherirán a la zona pelúcida que rodea el ovocito. La zona pelúcida es una barrera importante, y el espermatozoide debe realizar movimientos vigorosos para atravesarla. Generalmente, solo uno de estos espermatozoides logrará atravesar la zona pelúcida, llegar a la superficie del ovocito y penetrar en él. Aunque la movilidad del espermatozoide es esencial para que llegue al ovocito, la morfología del espermatozoide también parece ser importante para asegurar el éxito de la fecundación in vitro clásica.
Esquema de fecundación in vitro clásica
(Se muestra un esquema visual de la fecundación in vitro clásica).
Paso 1: Preparación del ovocito
Los ovocitos son desprovistos de la capa de células que los rodea (corona radiata). Para ello, se colocan en un medio que contiene enzimas diseñadas para disociar y dispersar estas células. Este es el paso de «decoronización», que luego se completa utilizando pipetas muy finas. En esta etapa, es posible clasificar los ovocitos maduros de los inmaduros.
El ovocito maduro se caracteriza por la presencia del primer cuerpo polar en el espacio perivitelino (entre la superficie del ovocito y la zona pelúcida)
El ovocito totalmente inmaduro presenta un núcleo grande llamado vesícula germinal.La maduración del ovocito generalmente se completa en el momento de la recolección de los ovocitos, pero ocurre que algunos de los ovocitos aún estén inmaduros. Los ovocitos inmaduros suelen representar una proporción baja de los ovocitos recolectados.
Paso 2: Inyección del espermatozoide
Solo los ovocitos maduros son fecundables y podrán ser microinyectados. Para ello, se colocan en una caja de cultivo, bajo un microscopio equipado con dos micromanipuladores, que replican los movimientos del biólogo.
Estos micromanipuladores están conectados a dos agujas de vidrio llamadas micropipetas. La primera es una micropipeta de sujeción y se utiliza para inmovilizar el ovocito, mientras que la segunda es una micropipeta de inyección, que atrapa un espermatozoide (presionando sobre el flagelo) y lo introduce en el ovocito (microinyección).
En promedio, el 10% de los ovocitos no sobreviven a esta inyección debido a que son demasiado frágiles
Aquí tienes fotografías de las diferentes etapas de una FIV ICSI
1. El espermatozoide está en la micropipeta de microinyección.
2. La micropipeta de microinyección perfora la membrana del ovocito.
3. La micropipeta se introduce hasta el centro del ovocito.
4. El espermatozoide es introducido en el ovocito.
5. La micropipeta de microinyección es retirada.
IMSI (Inyección Magnificada de Espermatozoide) sigue el mismo proceso que la técnica ICSI, con la única diferencia de que los espermatozoides se observan con un microscopio especial. Esto hace que la selección sea más confiable.
La técnica IMSI permite aumentar el tamaño de los espermatozoides hasta 10,000 veces, a diferencia de la técnica ICSI, que los amplifica entre 200 y 400 veces.
Gracias al IMSI, es posible observar detalles que no son visibles de otra manera. Por ejemplo, la estructura de la cabeza del espermatozoide. Si esta presenta vacuolas (pequeños huecos o «cráteres»), esto sugiere que la fragmentación del ADN del esperma podría ser demasiado importante para permitir el embarazo. Los primeros resultados muestran que esta técnica es prometedora: aumenta la tasa de implantación y disminuye la tasa de abortos espontáneos. El laboratorio será quien le aconseje sobre qué técnica utilizar, y su médico podrá solicitar un test previo, conocido como «Pre-IMSI», para determinar si esta técnica es necesaria.
Clasificación de los espermatozoides:
Los espermatozoides se clasifican de acuerdo con su calidad, de grado 1 (sin vacuolas) a grado 4 (con muchas vacuolas).
Esta técnica ha estado siendo utilizada en algunos centros de París durante más de dos años y probablemente se extenderá a otros centros de fertilidad en Francia en los próximos años.
Clasificación de imágenes:
A. ICSI
B. IMSI
C. IMSI sin vacuola
D. IMSI con vacuola
A. ICSI / B. IMSI / C. IMSI sin vacuola / D. IMSI con vacuola
Actualmente, la nomenclatura de los procedimientos de biología médica no ha incluido esta técnica entre los actos reembolsables, por lo que existe un costo adicional no reembolsado de aproximadamente 250 €, que se añade al costo de una ICSI normal.
Aproximadamente solo el 60 % de los ovocitos son fecundados. Este porcentaje define lo que se conoce como la tasa de fecundación.
Existen tres tipos de causas que pueden explicar este fallo en la fecundación:
En términos generales, se puede decir que un ovocito completamente maduro tiene muchas posibilidades de ser fecundado; un ovocito incompletamente maduro tiene menos probabilidades de iniciar la fecundación y, si la inicia, tiene menos posibilidades de completarla; un ovocito totalmente inmaduro tiene muy pocas posibilidades de comenzar una fecundación y no la terminará. Los ovocitos «sobremaduros» o envejecidos, ya sea in vivo o in vitro, también son menos fecundables, aunque este caso es menos frecuente.
Los ovocitos «atréticos», es decir, aquellos que han comenzado un proceso de degeneración antes de la punción, no se fecundan.
Los ovocitos provenientes de ovarios endometriósicos tienen menos probabilidades de ser fecundados.
En la FIV clásica, la disminución de la calidad del esperma provoca una disminución en la tasa de fecundación. Así, en todos los intentos (por lo tanto, con ovocitos de diversas maduraciones), la tasa de fecundación es del 66 % con un esperma de buena calidad, y disminuye hasta el 0 % con esperma de muy mala calidad. De hecho, el número de espermatozoides fecundantes disminuye a medida que la calidad del esperma empeora.
En la ICSI, la calidad del esperma no debería influir, ya que la fecundación se «bypass» mediante la técnica misma. Sin embargo, los resultados parecen ser peores cuando los espermatozoides están inmóviles.
El medio de cultivo puede estar contaminado por bacterias; en la gran mayoría de los casos, esta contaminación es causada por bacterias presentes en el esperma. Esto afecta a menos del 1 % de los intentos.
Algunos ovocitos pueden perderse o dañarse debido a una rotura de la zona pelúcida, la cual generalmente es consecuencia de problemas técnicos durante la punción (variaciones bruscas de presión). Esto afecta aproximadamente al 1 % de los ovocitos.
En la ICSI, la aguja de microinyección puede dañar el ovocito en ocasiones; este problema debería afectar solo al 2 % de los ovocitos
DÍA 1: EL PRIMER DÍA DESPUÉS DE LA PUNCIÓN: OBSERVACIÓN DE LA FECUNDACIÓN
A la mañana siguiente, entre las 7 y las 9 de la mañana, todos los ovocitos inseminados (FIV clásica) o microinyectados (FIV ICSI) son observados.
Se puede saber si ha habido fecundación si dos pequeños núcleos son claramente visibles en el centro del ovocito: uno de ellos es el núcleo masculino y el otro el núcleo femenino. La ausencia de estos núcleos casi siempre indica un fracaso.
Los ovocitos fecundados son llamados zigotos o «2 pronúcleos» (2PN) y son transferidos a otra caja de cultivo con un medio nuevo más adecuado para su desarrollo.
A lo largo de este nuevo día, en cada zigoto, los cromosomas de los dos núcleos se ensamblan. Esta célula única del zigoto inicia una primera división y da lugar a dos células idénticas: el zigoto se ha convertido en un embrión.
Estos zigotos pueden ser evaluados mediante el Z-score, el «puntuaje de los zigotos», observando la apariencia de los pronúcleos.
Sin embargo, en Francia, este método se utiliza muy poco, a diferencia de Alemania, donde la congelación de zigotos está permitida, pero no la de embriones en estadio celular. Esto permite cultivar los zigotos con mayores probabilidades de implantarse para transferirlos «frescos» y congelar los demás.